Papirkromatografi. Partitionskromatografi. papirkromatografi (kromatografi på papir) Metode til kromatografi på papir
Papirkromatografimetode henviser til plankromatografi, den er baseret på fordelingen af analytter mellem to ublandbare væsker.
Ved partitionskromatografi sker adskillelsen af stoffer på grund af forskelle i fordelingskoefficienterne for komponenter mellem to ublandbare væsker. Stoffet er til stede i begge faser som en opløsning. Den stationære fase tilbageholdes i porerne i det kromatografiske papir uden at interagere med det, papiret fungerer som en bærer af den stationære fase.
Typer af kromatografipapir:
hydrofilt papir bevarer op til 22% vand i sine porer; stationær fase - vand, mobil fase - organisk opløsningsmiddel; Dette papir bruges til at bestemme vandopløselige stoffer.
hydrofobt papir afviser vand, så det er imprægneret med et ikke-polært organisk opløsningsmiddel (stationær fase); mobil fase - vand; Dette papir bruges til at bestemme vanduopløselige forbindelser (fedtopløselige syrer, vitaminer).
Følgende krav gælder for kromatografisk papir:
kemisk renhed;
kemisk og adsorptionsneutralitet med hensyn til de analyserede stoffer og den mobile fase;
ensartethed i tæthed;
samme retning af fibre.
For at opnå et kromatogram anbringes en dråbe af blandingen, der analyseres, på papir. Papiret anbringes i det kromatografiske kammer, dets ende nedsænkes i en beholder med eluenten. Opløsningsmidlet bevæger sig langs papiret, blandingen af analytter fordeles mellem den mobile og stationære fase og adskilles på papiret i form af pletter eller striber. Positionen af komponentzonerne bestemmes ved at udvikle kromatografisk papir med passende reagenser, som danner farvede forbindelser, hvor komponenterne i blandingen adskilles.
For at kvantificere evnen til at adskille stoffer i et kromatografisk system bruges fordelingskoefficienten K p - forholdet mellem koncentrationen af et stof i den stationære og mobile fase. Eksperimentel bestemmelse af fordelingskoefficienter i denne metode er umulig for at vurdere evnen til at adskille stoffer på papir, forskydningskoefficienten R f anvendes. Forskydningskoefficienten er lig med forholdet mellem stoffets bevægelseshastighed () og bevægelseshastigheden af den mobile fase ( 
). Eksperimentelt findes værdien af R f som forholdet mellem afstanden X tilbagelagt af stoffet og afstanden X f tilbagelagt af opløsningsmidlet fra starten til frontlinjen:
.
Koefficienten Rf varierer inden for området 0 – 1,00. Værdien af Rf afhænger af arten af det stof, der bestemmes, typen af kromatografisk papir, kvaliteten og arten af opløsningsmidlet, metoden til påføring af prøven, den eksperimentelle teknik og temperatur. Rf-koefficienten afhænger ikke af koncentrationen af analytten og tilstedeværelsen af andre komponenter.
Identifikation Kromatogrammet udføres på følgende måder:
visuel sammenligning af den karakteristiske farve af zoner af stoffer i de undersøgte og standardkromatogrammer;
ved at måle mobilitetskoefficienterne Rf for standarden og analytten i et specifikt opløsningsmiddel. Kromatografi og bestemmelse af Rf for test- og standardblandingerne udføres på samme papir og i samme kammer under strengt identiske forhold. Ved at sammenligne koefficienterne Rf drages en konklusion om tilstedeværelsen af visse komponenter i den analyserede blanding.
kvantificering udføres direkte fra kromatogrammet eller ved at vaske (eluere) analytten fra papiret.
Metoder til kvantitativ analyse:
visuel sammenligning af farveintensiteten af pletter på testen og standardkromatogrammer (semi-kvantitativ bestemmelse, nøjagtighed 15-20%);
måling af området af stedet dannet af en given komponent og find koncentrationen af stoffet ved hjælp af en kalibreringsgraf konstrueret til en række standardløsninger i koordinaterne: pletareal - koncentration af stoffet; bestemmelsesnøjagtighed 5 – 10 %;
eluering af analytten fra overfladen af kromatogrammet og spektrofotometrisk eller fluorimetrisk måling af eluatets optiske densitet (A); koncentrationen af et stof i opløsning beregnes ved hjælp af formlen:
,
hvor K er proportionalitetskoefficienten; S – pletareal, målt tidligere, mm 2 ; bestemmelsesnøjagtighed 1 %.
Ifølge kromatografimetoden er der stigende (fig. 21), faldende (fig. 22), cirkulær (fig. 23), gradient- og todimensionel kromatografi.
|
Ris. 21. Kammer til stigende kromatografi: 1 – prop; 2 - krog; 3 - glasbeholder; 4 - strimmel papir; 5 - opløsningsmiddel |
|
|
Ris. 22. Kromatografisk kammer til nedadgående kromatografi: 1 – opløsningsmiddel; 2 - tværstang til papir; 3 - strimmel papir; 4 - glasbeholder; 5 – strømmende opløsningsmiddel |
|
|
Ris. 23. Adskillelse af stoffer ved hjælp af cirkulær kromatografi: 1 – kromatografisk papir; 2 - dæksel; 3 - Petriskål; 4 – organisk opløsningsmiddel |
Papirkromatografimetoden bruges i vid udstrækning til bestemmelse af uorganiske forbindelser, aminosyrer, aminer, proteiner, kulhydrater, fedtsyrer, phenoler, vitaminer i den kemiske, fødevare-, farmaceutiske industri, medicin og biokemi.
Metoden har fundet anvendelse i analysen af næsten alle fødevarer: i sukkerproduktion - til bestemmelse af kulhydrater; i bagning og konfekture - aminosyrer, organiske syrer, kulhydrater, polysaccharider og carbonylforbindelser; i vinfremstilling - organiske syrer og aminosyrer; i produktionen af mælk og mejeriprodukter - aminosyrer; i kødforarbejdningsindustrien - phenoler, fedt- og flygtige syrer, aminosyrer og carbonylforbindelser.
På papir (a. papirkromatografi; n. Papierchromatographie; f. Chromatographie sur papier; i. cromatografia sobre papel) - en metode til at adskille og analysere blandinger af stoffer baseret på deres fordeling mellem den mobile og stationære væskefase; papir bruges som bærer af den stationære væskefase. Metoden blev foreslået af de engelske videnskabsmænd A. Martin og R. Shingo i 1941.
Ved papirkromatografi bruges specielle papirkvaliteter, der varierer i antal, og når de øges, øges papirets tæthed. Papiret tilbageholder vand i sine porer, som er den stationære væskefase. Prøveopløsningen påføres i form af dråber på et ark papir i en vis afstand fra kanten. Efter at opløsningsmidlet er fordampet, placeres kanten af arket i et forseglet kammer indeholdende en fremkalder - en mobil flydende fase (f.eks. alkoholer, ketoner, phenoler, tetrachlorid, chloroform og andre blandinger deraf samt blandinger med uorganiske opløsningsmidler ). I dette tilfælde bevæger den indledende plet sig langs fremkalderstrømmen, og blandingen adskilles i komponenter. Hvis stofferne ikke er farvede, så udvikles kromatogrammet for eksempel ved at sprøjte med en indikatoropløsning, undersøges i ultraviolette stråler osv. Forholdet mellem afstanden Rf tilbagelagt af plet I og afstanden tilbagelagt af fremkalderens forside. m, under de samme forsøgsbetingelser, er en konstant værdi; Rf-værdier varierer for forskellige stoffer og kan bruges til at identificere forbindelser. Kvantitative bestemmelser af forskellige stoffer i kromatogrampletter udføres ved hjælp af konventionelle analysemetoder. Der er en-dimensionelle, to-dimensionelle, cirkulære, søjle og elektroforetiske kromatogrammer (fig.).
Endimensionelle kromatogrammer optages ved anvendelse af den ovenfor beskrevne metode. Et todimensionelt kromatogram opnås ved at adskille pletter af et endimensionelt kromatogram med en anden fremkalder i en retning vinkelret på den første række af pletter. På et cirkulært kromatogram er en plet placeret i midten af arket sløret langs koncentriske cirkler. Ved papirsøjlekromatografi udføres adskillelse på papirskiver, der er tæt indsat i en cylindrisk søjle. For at opnå elektroforetiske kromatogrammer imprægneres et papirark med en elektrolyt, fikseres mellem elektroderne, den analyserede blanding påføres, elektroderne forbindes til en jævnstrømskilde, og samtidig påføres papiret et mobilt opløsningsmiddel i en retning vinkelret på retningen af de elektriske strømlinjer. I denne metode sker adskillelsen af komponenter på grund af deres ulige fordeling mellem de to væskefaser og forskellige bevægelseshastigheder af stoffer under påvirkning af et elektrisk felt.
Papirkromatografi bruges til at adskille og analysere uorganiske og organiske stoffer i naturlige og industrielle materialer (for eksempel bestemme harpiks i olieprodukter, sjældne jordarters grundstoffer i og).
DEN RUSSISKE FØDERATIONS SUNDHEDSMINISTERIE
GENERELT PHARMAKOPOEIISK ARTIKEL
KromatografiOFS.1.2.1.2.0002.15
på papir i stedet for art. GFXI, udgave 1
Den kromatografiske proces, der finder sted på et ark filterpapir, mens det bevæger sig langs dets kapillærer og overfladen af den mobile fase, kaldes kromatografi på papir.
Den stationære fase er enten selve papiret eller stoffer, der tidligere er påført dets fibre. Mekanismen for papirkromatografi kan være partition eller adsorption. Bevægelsen af den mobile fase sker enten kun under påvirkning af kapillærkræfter (stigende kromatografi) eller under påvirkning af kapillærkræfter og tyngdekraft (nedadgående kromatografi).
Under kromatografi danner de analyserede stoffer adsorptionszoner på papir i form af runde eller ovale pletter eller striber afhængigt af påføringsmetoden (prik eller stribe). Sættet af adsorptionszoner opnået ved kromatografi af en given analyseret prøve kaldes et kromatogram.
Et stofs mobilitet under kromatografi er karakteriseret ved retentionsfaktoren R f, (se).
Anvendelsesområde
Papirkromatografi kan bruges til at bestemme identiteten, renheden og kvantificeringen af analytten.
Identiteten bekræftes ved samtidig kromatografi af de analyserede og standardstofferne på samme ark papir. Hvis prøverne er identiske, har de tilsvarende adsorptionszoner på kromatogrammerne samme udseende og samme værdier R f. Til identifikation er det nogle gange tilrådeligt at kromatografere en blanding af lige store mængder af analytten og standardstoffet. Kromatogrammet skal vise én plet, der karakteriserer adsorptionszonen. Kromatografibetingelser bør vælges således, at værdierne R f var forskellige fra 0 og oversteg ikke 1. For at bekræfte ægtheden af analytten kan der desuden anvendes specifikke betingelser for dets påvisning specificeret i farmakopémonografien.
Ved test for renhed skal urenhederne og hovedstoffet have forskellige værdier. R f. Renhedsgraden af det analyserede stof kan bedømmes ud fra størrelsen og intensiteten af farve (eller absorption) af urenhedsadsorptionszonerne påvist på kromatogrammet. Urenhedsindholdet kan bestemmes semikvantitativt. For at gøre dette chromatograferes en vis mængde af det analyserede stof og flere prøver af den bestemte urenhed (vidne) med forskellige, præcist kendte koncentrationer samtidigt på ét ark papir. Indholdet af en urenhed i den analyserede prøve vurderes ved at sammenligne dens adsorptionszone på kromatogrammet baseret på det samlede areal af adsorptionszonen og farveintensitet (eller absorption) med vidnets adsorptionszoner.
Til kvantitativ analyse anvendes specielle instrumenter, der tillader målinger i de ultraviolette og synlige områder af spektret. For at behandle kromatogrammer i det synlige område af spektret, er det tilrådeligt at bruge flatbed-scannere og passende software.
Det er også muligt at kvantificere stoffer efter deres ekstraktion fra kromatogrammet. For at gøre dette skæres adsorptionszonerne ud, og analytten ekstraheres med et passende opløsningsmiddel. Analyttens indhold i ekstraktet eller den tørre rest efter destillation af opløsningsmidlet bestemmes ved en hvilken som helst metode, der er egnet til bestemmelse af små koncentrationer og under hensyntagen til analyttens struktur.
En prøve af testblandingen kan påføres enten punktvis på startlinjen eller i form af en ensartet strimmel langs hele startlinjen, mens den primære adsorptionszone vil ligne en plet, og i det andet tilfælde en strimmel parallel. til startlinjen.
Udstyr
For at udføre kromatografi på papir anvendes forseglede kamre, lavet af inert materiale, som gør det muligt at observere forløbet af separationsprocessen med kammerlåget lukket. Ofte bruges glasbægre eller cylindre med et formalet låg og yderligere forseglet som kamre. Låget kan have indløbshuller (porte) til tilsætning af opløsningsmiddel eller aflastning af overtryk i kammeret.
Ved udførelse af faldende kromatografi placeres et kar til den mobile fase (båd) i den øvre del af kammeret. Båden skal indeholde et volumen af mobil fase, der er tilstrækkeligt til at udføre mindst én kromatografi. Bådens længde skal overstige bredden af arket kromatografipapir. Kammeret skal være udstyret med anordninger til at fastgøre et ark kromatografisk papir i arbejdsstilling og til at indføre den mobile fase i båden.
Når der udføres stigende kromatografi, placeres den mobile fase enten i en båd installeret i bunden af kammeret eller hældes på bunden af kammeret.
Kammerets indvendige vægge er foret med filterpapir, hvilket letter hurtigere og mere fuldstændig mætning af kammeret med opløsningsmiddeldampe inkluderet i den mobile fase.
Udarbejdelse af udstyr, kromatografisk papir og mobil fase er givet i farmakopémonografier.
Kromatografiske separationsteknikker
Papirkromatografi kan være en-dimensionel eller to-dimensionel.
Endimensionel papirkromatografi involverer pletpåføring eller påføring i form af en strimmel af en prøve af blandingen under undersøgelse på startlinjen og efterfølgende kromatografi i én retning (fig. 1).
Figur 1 – Tilnærmet skema for endimensionel papirkromatografi
Todimensionel kromatografi involverer sekventiel passage af den mobile fase i to vinkelrette retninger, hvilket muliggør en klarere adskillelse af blandingen af analytter (fig. 2).
Figur 2 – Tilnærmet skema for todimensionel papirkromatografi
Faldende kromatografi
En stationær eller mobil fase anbringes i bunden af det kromatografiske kammer i en mængde, der er tilstrækkelig til at danne et lag 2,5 cm dybt. Kammeret lukkes og efterlades til at mætte i 24 timer ved en konstant temperatur. I nogle tilfælde kan denne tid reduceres, hvis der anvendes tilstrækkeligt flygtige opløsningsmidler.
Opløsninger af stoffer påføres startlinjen med en mikropipette eller mikrosprøjte, således at afstanden mellem påføringspunkterne for de enkelte prøver er mindst 3 cm. Hvis den minimale mængde af den analyserede opløsning, der kræves til kromatografi, kan danne en primær adsorptionszone på papiret i form af en plet på mere end 10 mm i diameter , påføring udføres i flere trin, hvilket forhindrer overdreven diffusion på startlinjen ved tørring. Efter påføring af opløsningerne af de analyserede stoffer og tørring af det resulterende primære kromatogram fikseres papirstrimlen i arbejdspositionen i kammeret og efterlades i 1,5 time i arbejdspositionen skal strimmelen af kromatografisk papir hænge lodret dens øvre ende, nedsænket i båden, og startlinjen var kun et, så glat som muligt, bøjning. Ved afslutningen af eksponeringen begynder kromatografi, hvortil den mobile fase hældes i båden. Kromatografi afsluttes sædvanligvis, når forsiden af den mobile fase nærmer sig den nederste ende af papirstrimlen. Hvis der ikke er særlige instruktioner i farmakopémonografien, fjernes strimlen fra kammeret og tørres i luft, hvorved den endelige position af mobilfasefronten markeres med en grafitblyant. Påvisning af adsorptionszoner udføres i henhold til instruktionerne i farmakopémonografien.
Stigende kromatografi
For at udføre stigende kromatografi på papir anvendes kamre, hvori fartøjet (båden) med den mobile fase er placeret i den nederste del eller i bunden. En strimmel kromatografipapir er fastgjort i toppen af kammeret, således at den nederste ende af strimlen kan nedsænkes i båden, der indeholder den mobile fase. I strimlens arbejdsposition skal startlinjen være 2-3 cm fra overfladen af den mobile fase. Ellers adskiller arbejdsmetoderne ved udførelse af stigende kromatografi på papir sig ikke fra dem, der er beskrevet ovenfor.
Udarbejdelse af faser og papir
Ved fremstilling af ublandbare opløsningsmiddelsystemer, der anvendes sammen i kromatografi som en mobil og stationær fase, er det nødvendigt at sikre deres gensidige mætning, for eksempel ved at ryste i en skilletragt. I dette tilfælde skal farmakopémonografien angive, hvilken fase der anvendes til kromatografi.
Filterpapir med den krævede tæthed, kvalificeret "til kromatografi", skæres i retningen vinkelret eller parallelt med fibrene i ark (strimler), hvis længde er omtrent lig med kammerets højde. Bredden af disse striber kan tilnærmelsesvis bestemmes af formlen: EN = 3(TIL+ 1), hvor EN– strimmelbredde (cm), TIL– antal kromatogrammer på strimlen.
På hver papirstrimmel, for at angive anvendelsesstederne for de kromatograferede stoffer, tegnes en lige linje, kaldet startlinjen, med en grafitblyant. Afstanden fra enden af papirstrimlen til startlinjen er valgt således, at når papiret er nedsænket i båden, er direkte kontakt mellem stofferne påført startlinjen med væsken i båden udelukket.
Hvis det er angivet i farmakopémonografien, påføres den stationære fase på ark filtrerpapir, der er fremstillet på denne måde. For at gøre dette blandes de tilsvarende lavtflygtige opløsningsmidler (formamid, propylenglycol osv.) med meget flygtige opløsningsmidler, og papirarkene, der skal behandles, nedsænkes i den resulterende blanding i 1-2 s. Den overskydende blanding fjernes fra overfladen af arkene ved at klemme dem mellem to lag filterpapir, hvorefter blandingens flygtige komponent fjernes ved lufttørring i 15-20 minutter.
Hvis en vandig opløsning af ikke-flygtige stoffer anbefales som en stationær fase, behandles papiret med denne opløsning, tørres som angivet ovenfor, og før kromatografi opbevares i et kammer indeholdende vanddamp. Påføringen af meget flygtige komponenter af stationære faser på papir udføres ved at holde det i fasedamp i kammeret umiddelbart før kromatografi.
Påvisning af adsorptionszoner
Ved afslutningen af kromatografien tørres kromatogrammerne, indtil spor af opløsningsmidler er fjernet og ses i synligt eller ultraviolet lys (ved en bestemt detektorbølgelængde specificeret i farmakopémonografien), mens adsorptionszonerne markeres. For at detektere adsorptionszoner behandles kromatogrammet i nogle tilfælde med specielle reagenser, der danner farvede reaktionsprodukter med de analyserede stoffer, ved sprøjtning eller nedsænkning i en reagensopløsning.
Metoden til påvisning af adsorptionszoner skal angives i den tilsvarende farmakopémonografi for lægemidlet.
Ved papirkromatografi er den stationære væskefase vand, adsorberet af papirfibre i en mængde på op til 20 %, eller et andet polært opløsningsmiddel; Butylalkohol, collidin, phenol og cresoler bruges oftest som den mobile fase. Bæreren er godt filtreret papir, ret ensartet i tykkelse og tæthed.
For at adskille blandingen ved hjælp af papirkromatografi påføres en dråbe af testopløsningen på en strimmel filtreret papir 15-20 mm bred og 300-500 mm lang i en afstand på 20-30 mm fra enden. Enden af strimlen nedsænkes i et passende organisk opløsningsmiddel, som tidligere er mættet med vand, og hele indretningen anbringes i et forseglet kammer, hvor atmosfæren er mættet med dampe af et organisk opløsningsmiddel og vand. Bevægelsen af opløsningsmidlet langs papirstrimlen, på grund af kapillærkræfter, sikrer udviklingen af kromatogrammet, med individuelle zoner, der bevæger sig med forskellige hastigheder.
Todimensionel papirkromatografi
Endnu mere nøjagtige resultater opnås ved hjælp af såkaldt todimensionel papirkromatografi. Til denne mulighed skal du ikke bruge strimler af filtreret papir, men rektangler, der måler ca. 400x500 mm. En dråbe af testopløsningen påføres nær et af rektanglets hjørner, og kromatogrammet udvikles to gange med forskellige opløsningsmidler, for eksempel phenol og collidin, først med et opløsningsmiddel og derefter, efter at have roteret med 90?, med et andet .
Metoder til udvikling af kromatogrammer
Stigende kromatografi. Papiret nedsænkes med sin nederste ende i den mobile fase. Væskestigningen sker under påvirkning af kapillærkræfter.
“+” Enheden er enkel, kvantitativ vurdering af resultaterne er mulig;
"-" Tyngdekraften og kapillærkræfterne virker i modsatte retninger; sugehastigheden falder markant efter at være steget til 20 cm. Gælder for stoffer med ret store forskelle i Rf-værdier
Faldende kromatografi. Papiret nedsænkes i den mobile fase med dens øvre ende. Væskedræning sker under påvirkning af tyngdekraften.
"+" - hurtig passage af den mobile fase; ingen begrænsning på pletternes vejlængde (flowkromatogram); Det er muligt at adskille stoffer med lidt forskellige Rf-værdier og kvantificere resultaterne.
"-" - Enheden er mere kompleks end til stigende kromatografi.
Ris. 5.
Radial-horisontal kromatografi. Den mobile fase påføres kontinuerligt på midten af et cirkulært stykke papir.
"+" - Hurtig udførelse, zoner er smalle og skarpt definerede; større adskillelsesfuldstændighed end for de første metoder.
"-" - Kun en kvalitativ vurdering af resultaterne er mulig; brugen af "vidner" er kun mulig med den såkaldte "hemmelige metode" (dvs. opdeling af papiret i sektorer).
Forberedelse af den mobile fase
Det enkleste tilfælde af kromatografi på papir er beskrevet nedenfor - stigende kromatografi med vand som opstigende fase.
Komponenterne i det valgte opløsningsmiddelsystem blandes i det specificerede forhold i en skilletragt. De to ublandbare faser bringes til gensidig mætning ved omrystning; Den organiske fase fungerer som den mobile fase.
Anvendelse af stoffet
En strimmel skæres ud af en bestemt type papir, hvis størrelse svarer til størrelsen på cylinderen, der bruges til kromatografi. I en afstand af 3 cm fra den nederste kant påføres en markeringslinje med en blyant. På denne linje er startpunkter markeret 2 - 2,5 cm fra hinanden og fra strimlens kanter. Hvert udgangspunkt påføres med en speciel pipette; dette giver pletter omkring 1 cm i diameter. Opløsningsmidlet får derefter lov til at fordampe.
tyndtlagskromatografi opløsningsmiddel papir
Manifestation
Den mobile fase hældes i bunden af cylinderen, og en papirstrimmel suspenderes. Lad det hænge natten over, og derefter nedsænkes den nederste kant af strimlen 0,5 cm i den mobile fase. Efter at opløsningsmidlet er steget med 20-25 cm, fjernes strimlen, placeringen af opløsningsmiddelfronten markeres med en blyant, og kromatogrammet tørres.
Den kromatografiske proces, der finder sted på et ark filterpapir, mens det bevæger sig langs dets kapillærer og overfladen af den mobile fase,
kaldet papirkromatografi.
Den stationære fase er enten selve papiret eller stofferne
kogning påført dets fibre. Mekanismen for papirkromatografi kan være fordeling, adsorption eller ionbytning. Re-
bevægelsen af den mobile fase sker enten kun under påvirkning af kapillær
kræfter (stigende kromatografi), eller under påvirkning af kapillærkræfter og tyngdekraft (nedadgående kromatografi).
Under kromatografi dannes de analyserede stoffer på bukkal
magiske runde eller ovale pletter (zoner). Sættet af pletter opnået under kromatografi af en given analyseret prøve kaldes kromatografi
matogram.
Et stofs mobilitet under kromatografi er karakteriseret ved
metrisk Rf, som er forholdet mellem afstanden fra startlinjen til midten af stedet for analytten og afstanden fra startlinjen til frontlinjen af den mobile fase (se General Pharmacopoeia Monograph "Chromatography").
Ægtheden af det analyserede stof bestemmes samtidig
kromatografi på ét ark papir af de analyserede og stand-
gavestof. Hvis prøverne er identiske, har de tilsvarende pletter på kromatogrammerne det samme udseende og ens Rf-værdier. Til identifikation
Til dette formål er det nogle gange tilrådeligt at kromatografere en blanding af lige store mængder af analytten og standardstoffet. Kromatogrammet skal vise
give én plads. Kromatografibetingelser bør vælges således
så værdierne af Rf er forskellige fra 0 og 1.
Ved test for renhed skal urenhederne og hovedstoffet have forskellige Rf-værdier. I dette tilfælde kan man bedømme analyttens renhedsgrad.
af det stof, der analyseres efter størrelse og farveintensitet (eller absorption)
urenhedspletter påvist på kromatogrammet. Urenhedsindholdet kan bestemmes semikvantitativt. For at gøre dette, på et ark papir -
gi samtidig kromatografere en vis mængde af det analyserede
stof og flere prøver af den konstaterede urenhed (vidne) c
forskellige, præcist kendte koncentrationer. Indholdet af en urenhed i den analyserede prøve vurderes ved at sammenligne dens plet på kromatogrammet baseret på kombinationen af pletareal og farveintensitet (eller absorption) med
vidne pletter. Hvis urenhedspletterne er tilstrækkeligt ens i form og ca.
maling med pletter af hovedstoffet, taget i samme mængde, tilladt
det er muligt at anvende passende mængder af hovedstoffet som
som vidne.
Til kvantitativ analyse anvendes spektrofotometriske eller videodensitometre. Til behandling af kromatogrammer i det synlige område, speciel
Det er tilrådeligt at bruge flatbed-scannere og passende software.
Det er også muligt at kvantificere stoffer efter at de er blevet ekstraheret fra kromatogrammet. For at gøre dette skæres pletterne ud og ekstraheres
stof udskilles. Indholdet af analytten i ekstraktet eller den tørre rest efter destillation af opløsningsmidlet bestemmes ved en hvilken som helst metode
velegnet til at bestemme lave koncentrationer.
UDSTYR
For at udføre kromatografi på papir anvendes forseglet papir.
badekamre lavet af inert materiale og tillader
Observer forløbet af adskillelsesprocessen med kammerlåget lukket. Ofte bruges glasbæger eller cylindre med indgående elementer som kamre.
med et smedet låg og yderligere forseglet. Låget kan have indløbshuller (porte) til tilsætning af opløsningsmiddel eller aflastning af overtryk i kammeret.
Ved udførelse af faldende kromatografi placeres et kar til den mobile fase (båd) i den øvre del af kammeret. Båden skal indeholde en mængde mobil fase, der er tilstrækkelig til at udføre mindst én
multipel kromatografi. Bådens længde skal overstige bredden
Nå, et ark kromatografipapir. Kameraet skal være udstyret med
anordninger til fastgørelse af et ark kromatografipapir i arbejdsområdet
position og til at indføre den mobile fase i båden.
Ved udførelse af stigende kromatografi placeres den mobile fase
hæld enten i en båd installeret i bunden af kammeret, eller hæld
til bunden af kammeret.
Kammerets indvendige vægge er foret med filterpapir, hvilket letter hurtigere og mere fuldstændig mætning af kammeret med opløsningsmiddeldampe.
lei inkluderet i den mobile fase.
Udarbejdelse af udstyr, kromatografisk papir og mobil fase gives i private farmakopémonografier.
1.2. TYNDLAGSKROMATOGRAFI (OFS 42-0094-09)
Kromatografisk proces i et tyndt lag sorbent aflejret på en inert fast understøtning (glas, metal eller polymer)
neutron), kaldet tyndtlagskromatografi eller tyndtlagskromatografi
com lag af sorbent (TLC).
Adskillelse kan udføres af flere mekanismer: adsorp-
ation, distribution, ion-par, ion-bytning, udelukkelse-
nomu (gelgennemtrængende), chiral eller en hvilken som helst kombination deraf.
Som et resultat af bevægelsen af analytten og eluenten under påvirkning
Virkningen af kapillære kræfter adskiller blandingen af de undersøgte stoffer i dens komponenter. Ved adskillelse danner stoffer sorbenter på overfladen.
bøjede runde eller ellipsoide pletter eller striber (kromatografiske zoner).
Mobiliteten af et stof under adskillelse er karakteriseret ved værdien Rf
og R s (se General Pharmacopoeia Monograph "Chromatography", ligning 6 og Fig. 1.4).
Parametrene Rf og Rs bruges til at identificere stoffer og til at vurdere systemets adskillelsesevne.
Ægthedstest (identifikation) analyseret
stofferne udføres ved samtidig kromatografi af den samme mængde af analytten og en standardprøve på det samme kromatogram. Desuden, hvis stofferne er identiske, så har de tilsvarende kromatografiske zoner samme form, intensitet
absorption eller farve og lige værdier af Rf.
Når den er testet for renhed Hovedstoffet og urenhederne under kromatografibetingelser bør have forskellige Rf-værdier. I dette tilfælde kan man bedømme renhedsgraden af det analyserede stof ud fra størrelsen og intensiteten
pletterne af urenheder påvist på kromatogrammet. Deres indhold kan bestemmes semi-kvantitativt. For at gøre dette påføres visse mængder af analytten og vidner på pladen. At bestemme
opdeling af identificerede urenheder anvendes standardprøver af identificerede urenheder som vidner i mængder svarende til
svarende til deres ultimative indhold. For at fastslå ikke-identificerbar
af urenheder bruges referenceopløsninger oftest, tilberedt
fortyndes ved at fortynde testopløsningen som specificeret i privaten
Macopean artikel. Urenhedsindholdet i det analyserede stof er estimeret
De udføres ved at sammenligne urenhedszonen med hensyn til totaliteten af dens størrelse og intensitet med de tilsvarende pletter af vidnet.
kvantificering stoffer i kromatogrammet udføres,
sædvanligvis densitometrisk.
Grundlæggende enheder og materialer:
– plader med et fast lag af sorbent af forskellige modifikationer;
– kromatografiske kamre;
– kalibrerede kapillærer og mikrosprøjter;
– anordninger til påføring af detektionsreagenser på kromatogrammer -
produkter (sprøjtepistoler, kamre til nedsænkning af chro-
matogrammer i opløsning osv.);
– standard stoffer, opløsningsmidler, reagenser til påvisning af chrom-
totografiske zoner;
ultrakemiskoper med UV-lamper ved 254 nm og 365 nm.
Den anvendte lygte skal opfylde følgende prøve.
Kontrol af lampens funktion. 5 µl silicagel G påføres pladen
0,04 % opløsning af natriumsalicylat i 96 % alkohol til lamper med maksimum og 3-
stråling ved 254 nm eller 5 µl 0,2 % opløsning af natriumsalicylat i alkohol
96 % for lamper med maksimal stråling ved 365 nm i form af en plet med en diameter på ca. 5 mm; stedet skal lyse.
Ved udførelse af analyser, afstanden mellem lampen og kromatografien
kammen bør ikke overstige den afstand, der bruges ved kontrol af lampens funktion.
Bemærk. Den anvendte alkohol skal være fri for fluorescerende stoffer.
Kromatografiske plader
TLC-pladen er en solid understøtning (glas
metal, metal eller polymer) med et lag sorbent påført. Tol-
sorbentlagtykkelse fra 0,1 til 0,25 mm for den analytiske version og fra 0,5
op til 2,0 mm til præparativ.
Færdiglavede kromatografiske plader kan indeholde fluorescerende
indikator til påvisning af stoffer, der absorberer UV
spektralområder ved 254 og 365 nm.
Partikelstørrelsen af sorbenten til den analytiske version af TLC er
5-20 µm. Sammen med sådanne plader kan du bruge meget effektive
kromatografiske plader indeholdende en sorbent med partikler på 5-7 μm. Sådanne plader gør det muligt at øge separationseffektiviteten og reducere detektionsgrænsen for kromatografiske zoner.
Der produceres også plader med monolitiske sorbenter og plader
ki med en koncentreringszone (tofaseplader). Seneste brug
bruges i farmaceutisk analyse til at adskille komplekse og heterogene blandinger (ekstrakter fra plantemedicinske råvarer, opløsninger af tabletter,
strøm med hjælpekomponenter, bløde doseringsformer, blandet
Kromatografikamre
Kromatografikamre bruges til lodret eller vandret
zoneeluering med forseglede låg. Kameraer til vandret
tal eluering er også udstyret med anordninger til tilførsel af eluent til pladen. Før analyse er kammerets indre vægge sædvanligvis foret med filterpapir fugtet med den mobile fase. Til lodret eluering anvendes kamre med en skillevæg i midten af bunden.
Brugen af et vandret elueringskammer giver mulighed for samtidig eluering fra modsatte sider af pladen.
stinkende, hvilket fordobler analyseproduktiviteten i forhold til
tion ved hjælp af et lodret elueringskammer. Dette reducerer også forbruget af den mobile fase med cirka 10 gange. i th-
i et vandret kammer sker bevægelsen af den mobile fase langs pladen kun på grund af kapillarkræfter, der er intet bidrag fra tyngdekraften, hvilket øger separationseffektiviteten sammenlignet med kamre til vertikale
cal eluering.
Mobile faser (MP)
Mobile faser (eluenter) skal helst være svagstrøm
tioner hverken med sorbenten (NF, stationær fase) eller med de adskillende komponenter
mine blandinger. PF bør også fordampe ret hurtigt fra overfladen af kromatogrammerne efter eluering.
At undertrykke dissociationen af polære molekyler af separationskomponenterne
stoffer af sur eller basisk karakter tilsættes til blandingen, der hældes
(modifikatorer).
Anvendelse af prøver
Hvis dette er angivet i private farmakopémonografier, er pladerne præ-
vaskes grundigt med opløsningsmiddel og aktiveres ved opvarmning i 1 time
ved 100–105 C i et tørreskab. Før påføring af prøver skal pladerne opbevares i en hermetisk lukket ekssikkator. Anvendelse af prøver
vise sig:
– kalibrerede kapillærer med en stump ende;
– stempelmikrosprøjter med en stump nåleende;
– semi-automatiske eller automatiske applikatorer.
Påføring udføres på to måder: i form af pletter (2-5 mm diameter
meter) med intervaller mellem pletter på mindst 10 mm og i form af lange striber
fra 10 til 20 mm med et mellemrum mellem dem på mindst 10 mm. Startlinjens afstand fra underkanten af pladen skal være mindst 10 mm.
For at undgå "kanteffekter" af erosion af PF-fronten under elueringsprocessen,
før du påfører prøver, skrabe begge sider af planen af.
stinkende lag af sorbent 2-3 mm bredt. Afstandene på startlinjen fra pladens sidekanter til de steder, hvor den første og sidste prøve påføres, skal være
vi skal være mindst 10 mm. Under påføring af prøver er det uacceptabelt at
beskadigelse af sorbenten ved startlinjen. Tørring af de påførte prøver
optræde i en strøm af kold eller varm luft, eller på et specielt elektrisk opvarmet bord.
Elueringsmetoder
Følgende elueringsmetoder anvendes: stigende eluering
tion (enkelt- og flertrins, en-dimensionel og to-dimensionel - med rotation af planet
vægge ved 90 eller 180) og vandret.
Stigende kromatografi
Medmindre andet er angivet i en privat farmakopémonografi, placeres pladen med de påførte prøver lodret i kammeret, tidligere
mættet med PF-dampe i 1 time ved 20–25 C. PF-niveauet skal være placeret under startlinjen. Kammeret lukkes og processen udføres kl
20–25 C på et sted beskyttet mod lys. Efter at have passeret PF-fronten,
stående angivet i den private monografi, fjernes pladen fra kammeret, tørres og fremkaldes under de foreskrevne forhold.
Ved udførelse af todimensionel kromatografi tørres pladen efter kromatografi i den første retning og kromatograferes i en retning vinkelret på den første.
Horisontal kromatografi
Pladen med de påførte prøver placeres i kammeret og ledes ind
PF-strøm fra bakken til kammeret i henhold til instruktionerne for enheden til horisontal eluering. Processen udføres ved 20-25 C (hvis dette er angivet privat
Macopean artikel, samtidigt fra modsatte sider af pladen). med-
hvor PF passerer den distance, der er angivet i den private farmakopémonografi, pla-
Filmen fjernes, tørres og fremkaldes under foreskrevne forhold.
Todimensionel kromatografi udføres som beskrevet i afsnittet "Gendannelse"
nuværende kromatografi".
Detektionsmetoder
Detektion (detektion) af kromatografiske zoner efter testning
Kvalitative og semikvantitative TLC-tests udføres på følgende måder:
– observation under UV-lys;
– sprøjtning med opløsninger af detektionsreagenser;
– ved at holde detektionsreagenset i damp;
– nedsænkning i opløsninger af detektionsreagenser i specielle kamre.
Højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC)
Effektiviteten af adskillelse øges både på grund af en stigning i adskillelsesområdet mellem den mobile og stationære fase på grund af et fald i diameteren
meter sorbentpartikler, og på grund af den større ensartethed af størrelserne af disse partikler. Brug HPTLC plader lavet som normalt
fase (polær NF) og omvendt fase (ikke-polær NF) variationer
Sammenlignet med klassisk TLC tillader brugen af højtydende plader:
– øge antallet af analyserede prøver ved at reducere diameteren af startpletterne (op til 1–2 mm) eller strimmellængde (op til 5–10 mm);
– reducer hullerne mellem startpunkterne (op til 5 mm);
– reducere kromatografitiden ved at reducere rækkevidden af mobilfasefronten (MP);
– reducere forbruget (volumen) af PF;
– reducere grænserne for detektion af pletter og kvantitativ bestemmelse af analytter med 10-100 gange.
Brugen af HPTLC sikrer produktionen af mere kompakte pletter af de adskilte forbindelser, hvilket forbedrer mængdens metrologiske karakteristika
nøjagtig bestemmelse ved hjælp af scanning kromatodensitometri.
